CRM系統(tǒng)：白喉毒素?zé)o毒變異體CRM197 的表達(dá)及其載體作用

白喉毒素?zé)o毒變異體CRM197 的表達(dá)及其載體作用 王春娥葉強(qiáng)李鳳祥 【摘要】目的表達(dá)白喉毒素?zé)o毒變異體CRM197, 并考察其載體作用。方法利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌BL21 ( DE3) 中表達(dá)CRM197, 用金屬鎳離子親和層析純化; 以重組CRM197 為蛋白載體, 在EDAC 的作用下, 與活化的A 群腦膜炎球菌 莢膜多糖( GAMP) 結(jié)合, 制備GAMP-rCRM197 結(jié)合物, 免疫BALB / c 小鼠, 間接ELISA 法測(cè)定血清中A 群腦膜炎球菌多糖特異 性IgG 抗體, 并分析其免疫原性。結(jié)果重組CRM197 在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá), 表達(dá)量占菌體總蛋白的25%左右; Western blot 證明重組CRM197 具有良好的反應(yīng)原性; 各針接種后, 結(jié)合物誘生的多糖特異性IgG 水平均顯著高于GAMP 組和 GAMP + rCRM197 混合物組, 具有較強(qiáng)的免疫原性; 多次接種產(chǎn)生了免疫增強(qiáng)效應(yīng), 重組CRM197 具有載體蛋白的作用。結(jié)論已 在大腸桿菌BL21( DE3) 中成功表達(dá)了重組CRM197, 以純化的重組CRM197 作為載體制備的GAMP-rCRM197 結(jié)合物具有良好的免 疫原性, 為以重組CRM197 為蛋白載體制備其他結(jié)合疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】白喉毒素; 無(wú)毒變異體; CRM197; 載體蛋白; 結(jié)合疫苗; A 群腦膜炎球菌 Expr ession of Nontoxic Diphther ia Toxin Mutant CRM197 as A Car r ier Protein WANG Chun-e, YE Qiang, LI Feng-xiang ( National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China) 【Abstr act】Objective To express the nontoxic mutant CRM197 of diphtheria toxin and study its effect as a carrier protein. Methods Express CRM197 in E. coli BL21 ( DE3) by gene engineering technique and purify the expressed product by nickel ion affinity chromatography. Link the purified CRM197 as a carrier protein to activated group A meningococcal polysaccharide( GAMP) , using EDAC as linker. Immunize BALB / c mice with the prepared GAMP- CRM197 conjugate and determine the specific IgG against GAMP in sera by indirect ELISA. Results Recombinant CRM197 was expressed in E. coli mainly in a form of inclusion body. The expressed product contained about 25% of total somatic protein and showed good reactogenicity as proved by Western blot. The IgG level against GAMP induced by GAMP- CRM197 conjugate was significantly higher than those by GAMP and by the mixture of GAMP and rCRM197. Repeated immunization with the conjugate induced immunopotentiation, indicating the effect of CRM197 as a carrier protein. Conclusion Recombinant CRM197 was successfully expressed in E. coli, and the GAMP-rCRM197 conjugate prepared with the purified expressed product showed good immunogenicity. It laid an experimental foundation of preparation of other conjugate vaccine using CRM197 as a carrier protein. 【Key words】Diphtheria toxin; Nontoxic mutant; CRM197; Carrier protein; Conjugate vaccine; Group A meningococcus 國(guó)際上應(yīng)用的載體蛋白主要有4 種: 破傷風(fēng)類(lèi) 毒素、白喉類(lèi)毒素、白喉毒素的無(wú)毒變異體CRM197 和B 群腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合體。而國(guó)內(nèi)研制的 結(jié)合疫苗多采用破傷風(fēng)類(lèi)毒素[ 1～3 ] , 此類(lèi)結(jié)合疫苗 雖然具有較好的免疫效果, 但破傷風(fēng)毒素相對(duì)分子 質(zhì)量較大, 致敏性較強(qiáng), 且存在毒性回復(fù)的危險(xiǎn)。使 用無(wú)毒性的蛋白十分有必要。CRM197 為白喉毒素的 無(wú)毒變異體, 經(jīng)研究證明其免疫原性與白喉毒素幾 乎無(wú)差別[ 4, 5 ] , 作為載體蛋白在國(guó)外已得到廣泛應(yīng) 用[ 6~8] 。目前, 國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)以CRM197 為載體的結(jié)合疫 苗研制的報(bào)道。本研究根據(jù)國(guó)內(nèi)外CRM197 的研究情 況及國(guó)內(nèi)腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的研制現(xiàn)狀, 采用基 因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)crm197 基因, 并對(duì)表 達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化, 以其作為蛋白載體, 制備了A 群腦 膜炎球菌結(jié)合物, 并初步研究了結(jié)合物的免疫原性。 1. 材料與方法 1. 1 菌株及質(zhì)粒 白喉棒狀桿菌C7( β197) 菌株( ATCC53281) 購(gòu)自 ATCC; pCR 2.1-TOPO 質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌TOPO10 購(gòu)自Invitrogen 公司; 質(zhì)粒pET-28a 和大腸桿菌BL21 ( DE3) 由本室保存。 1. 2 試劑 Ex Taq 酶、DNA marker 和凝膠回收試劑盒均購(gòu) 自寶生物工程( 大連) 有限公司; 質(zhì)粒小量提取試劑 盒購(gòu)自上海華舜公司; 限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自紐英倫生 物技術(shù)( 北京) 有限公司; 蛋白質(zhì)低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)購(gòu)自BIO-RAD 公司; Chelating SepharoseTM Fast Flow 和Sepharose 4 Fast Flow 購(gòu)自GE Healthcare; HRP 標(biāo)記的兔抗馬IgG 購(gòu)自北京欣經(jīng)科公司; 白喉 絮狀反應(yīng)抗毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品( 1000Lf) 由本所血清室 提供, 批號(hào)0048; A 群腦膜炎球菌莢膜多糖( GAMP) , 批號(hào)20050201, 由云南沃森生物技術(shù)有限公司提供; A群流腦診斷血清國(guó)家參考品, 批號(hào)2003, 效價(jià)1∶320, 由本室保存; CRM197 陽(yáng)性對(duì)照( 1 mg) 、溴化氰( CNBr) 、 1, 6-己二酰肼( ADH) 、碳二亞胺( EDAC) 和2, 4, 6-三 硝基苯磺酸( TNBS) 均購(gòu)自Sigma Aldrich 公司; 辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 為北京中杉金橋生 物技術(shù)有限公司原裝進(jìn)口分裝產(chǎn)品。 1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB / c 小鼠, 體重18 ~ 20 g, 雄性, 由 本所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1. 4 PCR 引物設(shè)計(jì)及合成 參考GenBank 中白喉毒素的編碼基因序列( 收 錄號(hào)為K01722) [ 9] , 用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6. 0 設(shè)計(jì) 引物, 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 引物序列如下: 上游: 5′-CGCATATGGGCGCTGATG ATGTTGTT- 3′( 引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)) ; 下游: 5′-AT GGATCCCGACCCCACTACCTTTCC-3′( 引入BamHⅠ 酶切位點(diǎn)) 。 1. 5 目的基因的擴(kuò)增及克隆 提取白喉棒狀桿菌C7( β197) 基因組DNA 作為 模板, 擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃ 30 s, 55℃ 退火1 min, 72℃ 延伸1. 5 min, 共30 個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳 分析擴(kuò)增片段的大小, 凝膠回收試劑盒回收目的片 段, 連接于pCR 2. 1-TOPO 載體, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿 菌TOP10, 挑選陽(yáng)性克隆, 提取質(zhì)粒, 經(jīng)NdeⅠ 和 BamHⅠ雙酶切鑒定后, 將陽(yáng)性克隆送上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。 1. 6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒, 與pET-28a 質(zhì)粒分別用NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切, 凝膠回 收相應(yīng)片段, 連接后, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21( DE3) , 篩選陽(yáng)性克隆, 提取質(zhì)粒, 進(jìn)行雙酶切鑒定。 1. 7 重組CRM197 的誘導(dǎo)表達(dá) 將含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒的大腸桿菌, 在37℃, 0. 2 mmol /L IPTG 的條件下誘導(dǎo)表達(dá)4 h, 離心收集 菌體, 超聲破碎, 分析重組CRM197 表達(dá)形式。 1. 8 重組CRM197 的純化 將包涵體分別用含1% Triton X-100 的Tris 緩 沖液( pH 8. 5) 和含2 mol / L 尿素的PBS 緩沖液 ( pH 7. 4) 洗滌, 進(jìn)行初步純化, 最后將包涵體沉淀用 含35 mmol / L 咪唑和8 mol / L 尿素的緩沖液溶解, 4℃, 12 000 r /min 離心20 min, 取上清, 加樣于金屬 螯合親和層析柱, 用含250 mmol /L 咪唑的緩沖液洗 脫。收集洗脫液, 進(jìn)行SDS-PAGE 分析, 凝膠成像分 析蛋白純度。將純化后的重組蛋白以梯度透析法除 去尿素和咪唑。 1. 9 重組CRM197 的鑒定 將純化后的重組CRM197 和陰性對(duì)照樣品[ pET- 28a /BL21( DE3) ] 經(jīng)SDS-PAGE 后, 用半干膠轉(zhuǎn)移儀 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜, 以白喉抗毒素( 馬血清) 為一抗, HRP 標(biāo)記的兔抗馬IgG 為二抗, 進(jìn)行Western blot 檢 測(cè)。 1. 10 GAMP-重組CRM197 結(jié)合物的制備 參考文獻(xiàn)[ 1~3, 10] 進(jìn)行。將GAMP( 6 mg /ml) 用 0. 1 mol /LNaOH 調(diào)pH 至10. 5 ±0. 2; 以0. 5 mg /mg GAMP 的比例緩慢加入CNBr, 并使pH 穩(wěn)定在10. 5 ± 0. 2, 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 min; 加入與多糖等體積的 0. 5 mol / L ADH ( 預(yù)先溶解于0. 5 mol / L NaHCO3 中) , 用0.1mol/LHCl 調(diào)整pH 穩(wěn)定在8.5 ±0.2, 室溫?cái)? 拌反應(yīng)20 min; 反應(yīng)體系于3 ～8℃攪拌反應(yīng)12 h 以 上后, 透析除去游離的CNBr 和ADH, 測(cè)定衍生物的 ADH 及O-乙酰基含量。 將衍生物與等量重組CRM197 混合, 用0. 1 mol /L HCl 調(diào)整pH 為6. 0 ～6. 2, 加入EDAC 粉末至終濃度 為0. 1 mol / L, 并維持pH 為6. 0 ～6. 2, 室溫?cái)嚢璺? 應(yīng)2 h; Sepharose 4 Fast Flow( XK 1. 6 cm ×90 cm) 層 析柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾純化, 同時(shí)監(jiān)測(cè)206 nm、280 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。 1. 11 結(jié)合物的檢測(cè) 1. 11. 1 生化檢測(cè): ADH 含量測(cè)定采用TNBS 法; O- 乙酰基含量測(cè)定采用Herstrin 法; 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用Lowry 法; 磷含量測(cè)定采用改良Chen 法; EDAC 殘留量按常規(guī)方法進(jìn)行。 1. 11. 2 抗原性檢測(cè): 采用免疫雙擴(kuò)散法, 按照《中 國(guó)藥典》三部( 2005 版) 方法進(jìn)行。 1. 11. 3 免疫原性檢測(cè): 將144 只雄性BALB / c 小 鼠隨機(jī)分為4 組, 每組36 只, 分別為:A 組:GAMP 組; B 組: GAMP + rCRM197 混合物組; C 組: GAMPrCRM 197 結(jié)合物組; D 組: 生理鹽水對(duì)照組。 皮下接種, 劑量為0. 2 ml / 只, 前3 組分別含多 糖2. 5 μg, 于第0、14、28 天接種, 第14、28、35 天眼 眶采血。離心收集血清, 用間接ELISA 方法測(cè)定血 清中多糖特異性IgG 抗體。以陰性對(duì)照血清平均吸 光度值的2. 1 倍作為Cutoff 值, 以吸光度> Cutoff 強(qiáng)力推薦： 天柏客戶(hù)關(guān)系管理系統(tǒng) 天柏客戶(hù)關(guān)系管理系統(tǒng)（CRM）是一款集專(zhuān)業(yè)性、實(shí)用性、易用性為一體的純B/S架構(gòu)的CRM系統(tǒng)，它基于以客戶(hù)為中心的協(xié)同管理思想和營(yíng)銷(xiāo)理念，圍繞客戶(hù)生命周期的整個(gè)過(guò)程，針對(duì)不同價(jià)值的客戶(hù)實(shí)施以客戶(hù)滿(mǎn)意為目標(biāo)的營(yíng)銷(xiāo)策略，通過(guò)企業(yè)級(jí)協(xié)同，有效的“發(fā)現(xiàn)、保持和留住客戶(hù)”，從而達(dá)到留住客戶(hù)、提高銷(xiāo)售，實(shí)現(xiàn)企業(yè)利潤(rùn)最大化的目的。通過(guò)對(duì)客戶(hù)進(jìn)行7P的深入分析，即客戶(hù)概況分